Práctica 20: Determinación cuantitativa de bilirrubina total

Determinación cuantitativa de bilirrubuna total

Objetivo

El objetivo de la práctica es determinar la concentración de bilirrubina total en nuestra muestra problema

Fundamento

La bilirrubina se convierte en azobilirrubina mediante el ácido sulfalínico diazotado midiéndose fotometricamente. De las dos fracciones presentes en suero, bilirrubin-glucurónido y bilirrubina libre ligada a la albúmina, solo la primera reacciona en medio acuoso (bilirrubina directa) precisando la segunda la solubilización con dimetilsulfóxido para que reaccione (bilirrubina indirecta). En la determinación de la bilurrubina indirecta se determina también la directa, correspondiendo el resultado a la bilirrubina total. La intensidad del color formado es proporcional a la concentración de bilirrubina presente en la muestra ensayada.

Significado clínico

La bilirrubina se origina por la degradación de hemoglobina. Es transportada del bazo al hígado y se excreta en la bilis. La hiperbilirrubinemia es el resultado de un incremento de la bilirrubina en plasma. 

Las causas más probables de la bilirrubinemia son: 

- Bilirrubina total: Aumento de la hemólisis, alteraciones genéticas, anemia neonatal, alteraciones eritropoyéticas, presencia de drogas,..

- Bilirrubina directa: Colestasis hepática, alteraciones genéticas y alteraciones hepáticas. 

El diagnóstico clínico debe realizarse teniendo en cuenta todos los datos clínicos y de laboratorio.

Materiales

• Pipetas automáticas

• Puntas de pipetas desechables

• Cubetas de espectofotometría

• Tubos de hemólisis de 3 mL

• Tapones

Muestra

• Suero o plasma

Reactivos

• R1- Ácido sulfanílico, ácido clorhídrico y dimetilsulfóxido

• R2- Sodio nitrito

• Bilirrubina CAL

Aparataje

• Espectofotómetro

Procedimiento

1. Encendemos el espectofotómetro y lo programamos a 555 nm
2. Preparamos las mezclas en distintos tubos:
- Blanco: 1,5 mL de R1 + 100 microlitros de muestra
- Patrón: 1,5 mL de R1 + 50 microlitros de R2 + 100 microlitros de calibrador
- Muestra: 1,5 mL de R1 + 50 microlitros de R2 + 100 microlitros de muestra
3. Incubamos durante 5 minutos a Tª ambiente
4. Leemos las absorbancias

Lectura y resultados

- Lecturas:

• Blanco: 0,000
• Patrón: 0,231
• Muestra: 0,222

- Cálculos:

(A) Muestra - (A) Blanco / (A) Patrón - (A) Blanco x Concentración del calibrado 

0,222 / 0,231 x 1,17 = 1,12 mg/ dL de bilirrubina total

- Bilirrubina indirecta

Bilirrubina total - Bilirrubina directa

1,12 - 0,41 = 0,71 mg/dl de bilirrubina indirecta