Práctica 6: Determinación cuantitativa de glucosa (Hexokinasa.Ezimático- UV)

Determinación cuantitativa de glucosa

Objetivo

El objetivo es poner en práctica la teoría vista en clase de la hexokinasa

Fundamento

La hexokinasa cataliza la fosforilación de la glucosa por ATP a glucosa-6-fosfato. La glucosa-6-fosfato originada es reducida a 6-fosfoglucanato en presencia de glucosa-6-fosfato deshidrogenasa con reducción paralela de NAD a NADH.

El aumento en la concentración de NADH en el medio es proporcional a la concentración de glucosa presente en la muestra ensayada.

Significado clínico

La glucosa es la mayor fuente de energía para las células del organismo; la insulina facilita la entrada de glucosa en las células. La diabetes miellitus es una enfermedad que cursa con una hiperglucemia, causada por un déficit de insulina. 

El diagnóstico clínico debe realizarse teniendo en cuenta todos los datos clínico y de laboratorio.

Materiales

• Micropipetas automáticas de 10 y 1000 microlitros

• Puntas de pipetas desechables

• Vaso de rechazo

• Tubos de hemólisis de 3 mL

• Tapones

• Cubetas de espectofotometría

Muestra

• Suero libre de hemólisis

Reactivos

• R1 Tampón - Tris pH7,5
• R2 Enzimas - NAD+, hexokinasa y glucosa-6-fosfato

• Patrón de glucosa  (CAL)

Aparataje

• Espectofotómetro 

• Baño termostático

Procedimiento

- Preparación del reactivo de trabajo

Para prepara el reactivo de trabajo (RT), debemos:

1. Disolver el contenido del R2 (enzimas) en el frasco del R1 (tampón)
2. Tapamos y mezclamos suavemente hasta disolver el contenido

- Determinación cuantitativa

1. Encendemos el espectofotómetro 15 minutos antes de empezar y lo programos a 340nm
2. Preparamos el blanco, el patrón y la muestra. Cada persona preparará su muestra problema, pero solo se hará un patrón y una muestra para cada mesa
3. En el tubo del blanco pipeteamos 1 mL (1000 microlitros) de RT
4. En el tubo del patrón pipeteamos 1mL (1000 microlitros) de RT y 10 microlitros de patrón de glucosa, y después resuspendemos para mezclar
5. En el tubo de la muestra problema pipeteamos 1 mL (1000 microlitros) de RT y 10 microlitros de suero y resuspendemos para mezclar
6. Incubamos el patrón y la muestra problema en el baño termostático durante 5 minutos a 37ºC
7. Sacamos los tubos 
8. Medimos el blanco para quitar interferencias
9. Medimos el patrón 
10. Medimos la muestra problema

**Como somos muchos en clase y hay que medir la muestra problema muy rápidamente ya que el color no aguanta mucho, hemos ido por tiempo:

- Preparamos el blanco y el patrón, lo incubamos durante 5 minutos y a los 3 minutos que pasen en el baño empezamos a preparar la primera muestra problema. 

Mientras la muestra está en el baño, medimos el blanco y el patrón y a los 3 minutos que esté la primera muestra en el baño, metemos la segunda y vamos midiendo. 

De esta manera, podemos medir todos y que los resultados salgan coherente.

Resultado

Absorbancias:

- Blanco: 0,000 A

- Patrón: 0,356 A

- Muestra: 0,856 A

Cálculos

(A)Muestra/(A)Patrón * 100= mg/dL de glucosa

0,856 A / 0,356 A * 100= 240,45 mg/dL de glucosa