Práctica 15: Determinación cuantitativa de triglicéridos

Determinación cuantitativa de triglicéridos

Objetivo

En esta práctica el objetivo es calcular la concentración de trigliceridos en la muestra

Fundamento

Los triglicéridos incubados con lipoproteinasa (LPL) liberan glicerol y ácidos grasos libre. El glicerol es fosforilado por glicerolfosfato deshidrogenasa (GPO) y ATP en presencia de glicerol quinasa (GK) para producir glicerol-3-fosfato (G3P) y adenosisa-5-fosfato (ADP). El G3P es entonces convertido es dihidroxiacetona fosfato (ADP) y peróxido de hidrógeno (H2O2) por GPO. 

Al final, el peróxido de hidrógeno (H2O2) reacciona con 4-aminofenazona (4-AF) y p-clorofenol, reacción catalizada por la peroxidasa (POD) dando lugar a una coloración roja.

La intensidad del color formado es proporcional a la concentración de triglicéridos presentes en la muestra ensayada.

Significado clínico

Los triglicéridos son grasas que suministran energía a la célula. Al igual que el colesterol, son transportados a las células del organismo por la lipoproteínas en la sangre. Una dieta alta en grasas saturadas o carbohidratos puede elevar los niveles de triglicéridos. 

Su aumeneto es relativamente inespecífico. Diversas dolencias, como ciertas disfunciones hepáticos o diabetes miellitus, pueden estar asociadas con su elevación.

El diagnostico clínico debe realizarse teniendo en cuenta todos los datos clínicos y de laboratorio.

Materiales

• Tubos de hemólisis de 3 mL

• Tapones

• Micropipetas automáticas 

• Puntas de pipetas desechables

• Cubetas de espectofotometría

Muestra

• Suero o plasma

Reactivos

• R1 Tampón

• R2 Enzimas

• Triglicéridos CAL (patrón)

Aparataje

• Baño termostático

• Espectofotómetro

Procedimiento 

- Preparación de los reactivos

1. Disolvemos el contenido del vial de R2 en el frasco de R1
2. Tapamos y mezclamos suavemente
3. Etiquetamos

- Preparación de las muestras

1. Encendemos el espectofotometro y lo programamos a 505 nm

2. En los tubos de hemólisis preparamos el blanco, el patrón y la muestra:

- Blanco: 1 mL de RT

- Patrón: 1 mL de RT +  10 microlitros de patrón

- Muestra: 1 mL de RT + 10 microlitros de suero

3.Mezclamos e incubamos a 37ºC durante 5 minutos

4. Leemos la absorbancia en el espectofotómetro

Lectura y resultado

Leemos las diferentes absorbancias con el espectofotómetro:

- Blanco: 0,000 A

- Patrón: 0,356 A

- Muestra: 0,298 A

Ahora hacemos los cálculos para conocer la concentración de triglicéridos:

(A)Muestra - (A)Blanco/ (A)Patrón - (A)Blanco x 200 (Conc.Pt)

0,298 / 0,356 x 200= 167,41 mg/dL

Aunque los valores sean muy bajos, el problema posiblemente este en el patrón; para ello volvimos a hacer el patrón y lo volvimos a medir y también la muestra preparada anteriormente y los niveles seguían siendo bajos.