Práctica 13: Inmunodotting para hepatitis autoinmunes

Inmunodotting para hepatitis autoinmunes

Objetivo

El objetivo de la práctica es ver si las muestras de las tiras dot, dan positivo o negativo según el Ac específico que se una 

Fundamento y significado clínico

La prueba se basa en el principio de Enzimoinmunoanálisis. Cada tira del test está compuesta por una membrana fijada sobre un soporte plástico; en dicha membrana se han dispensado directamente los distintos Ag anteriormente mencionados. Durante el desarrollo de la prueba, las tiras se incuban con suero diluido de los pacientes. Si dichos sueros contienen los auto-Ac buscados, se unirán especificamente al correspondiente Ag de los fijados en la membrana. Mediante un lavado eliminaremos el exceso de Ac que no se han unido a sus Ag para, posteriormente, añadir un conjugado de origen caprino marcado con ALP; dicho conjugado va dirigido contra la Ig G humana. El conjugado se une a los complejos Ag-Ac. Después de realizar un segundo lavado con el fin de eliminar el exceso del conjugado, se añade el sustrato que, por acción de la enzima ALP, se desarrollará una coloración púrpura en el lugar correspondiente de la membrana. Dicha coloración tendrá una intensidad directamente proporcional a la cantidad de Ac presente en la muestra.

Materiales

• Micropipetas automáticas

• Puntas de pipetas desechables

• Bandeja de incubación

• Tiras dot

Muestra 

• Tiras dot

Reactivos

• Tampón de lavado concentrado 10x

• Tampón de dilución
• Conjugado
• Sustrato

Aparataje

• Bandeja rotatoria

Procedimiento

1. Colocar una tira por paciente en un canal de la bandeja de incubación con los puntos azules mirando hacia arriba
2. Añadimos 2 mL de tampón de lavado en cada canal de uso. Incubar 10 minutos en agitación
3. Eliminar el líquido de los canales invirtiendo lentamente la bandeja y secamos el borde con papel absorbente
4. Añadimos 1,5 mL de tampón de dilución en cada uno de los canales utilizados
5. Añadimos 10 microlitros de muestra del paciente por canal e incubamos 30 minutos en incubación
6. Eliminamos el líquido de los canales invirtiendo lentamente la bandeja y secamos el borde con papel absorbente
7. Lavamos dos veces cada canal utilizado con 1,5 mL y lo dejamos agitando durante 3 minutos. Después de cada lavado, eliminamos el líquido de los canales invirtiendo lentamente la bandeja y secamos el borde con papel absorbente
8. Añadimos 1,5 mL de conjugado por canal e incubamos 30 minutos en agitación
9. Eliminamos el líquido de los canales invirtiendo lentamente la bandeja y secamos el borde con papel absorbente
10. Lavamos 2 veces cada canal con 1,5 mL de tampón lavado mientras lo dejamos durante 3 minutos en agitación. Después de cada lavado, eliminamos el líquido de los canales invirtiendo la bandeja lentamente y secamos el borde con papel absorbente
11. Añadimos 1,5 mL de sustrato por canal utilizado e incubamos 10 minutos en agitación
12. Eliminamos el líquido de los canales invirtiendo lentamente la bandeja y secamos el borde con papel absorbente
13. Extraemos las tiras de los canales y las dejamos secar sobre papel absorbente

Lectura y resultado

1. Despegamos la cubierta del adhesivo en la parte posterior de cada tira y colocar dichas tiras con los puntos boca arriba
2. El punto superior (control positivo) debe salir coloreado en todos los pacientes
3. En condiciones óptimas, y si la muestra está libre de sustancias que la interfieran, el control negativo (el inferior) será incoloro. Si aparece color en ese punto significa que ha habido uniones inespecíficas debidas a sustancias con capacidad de interferir y que están presentes en la muestra
4. Comparamos el punto correspondiente a cada Ag específico con el punto del control negativo
5. Finalmente, podemos comprobar que el resultado es negativo, ya que una muestra es negativa para un Ac específico si la intensidad de color del punto correspondiente a su Ag es menor o igual que la intensidad de color del control negativo.