Práctica 12: Determinación cromatográfica- espectofotométrica de la Hb A1c en sangre

Determinación cromatográfica-espectofotométrica de la Hb A1c en sangre

Objetivo

El objetivo de la práctica es medir el porcentaje de hemoglobina glicosilada Ac1 con la absorbancia de la hemoglobina total

Fundamento y significado clínico

Mezclando una alicuota de sangre completa con un agente hemolizante, se obtiene la lisis de los hematíes, la liberación de la hemoglobina contenida en ellos y la eliminación de la fracción lábil. La fracción Ac1 de la hemoglobina glicosilada es separada de la Hb A1c de la hemoglobina glicosilada es separada de la Hb A1A + B mediante cromatografía de intercambio catónico.
El porcentaje de HbA1c se obtiene por comparación de la absorbancia ( a 415 nm) del eluído con la absorbancia de la hemoglobina total.
El procedimiento no requiere ninguna calibración y puede realizarse en un rango de temperaturas de 20 a 28ºC.

Materiales

• Micropipeta automática

• Puntas de pipetas desechables

• Tubos de hemólisis de 10 mL

• Columna cromatográfica

• Tubo eppendorf

Muestra

• Sangre completa con EDTA

Reactivos

• Reactivo 1: Biftalato de potasio
• Reactivo 2: Tampón 42 mmol/L
• Reactivo 3: Tampón 50 mmol/L

Aparataje

• Espectofotómetro

Procedimiento

- Preparación del hemolizado

1. En un tubo eppendorf añadimos: 50 microlitros de sangre y 450 microlitros de reactivo 1
2. Mezclamos vigorosamente
3. Incubamos a Tª ambiente durante 10-15 minutos 

- Preparación de la hemoglobina total

1. En un tubo falcon añadimos 100 microlitros de hemolizado preparado anteriormente y 12 mL de agua destilada
2. Mezclamos y después mediremos la absorbancia de la hemoglobina total 

- Separción cromatográfica

1. Quitamos el tapón superios y rompemos la espita inferior para que la columna se vacíe. La ponemos sobre el tubo de desechos
2. Cuando este completamente vacío pipeteamos en la columna, sin tocar la membrana, 50 microlitros de hemolizado preparado
3. Esperamos 3 minutos y descartamos el eluído
4. Pipeteamos en la columna 2 mL de reactivo 2 y esperamos que se vacíe y descartamos el eluído
5. Cambiamos la columna de tubo, al de recogida de eluído y pipeteamos en su interior 2 mL de reactivo 3 y recogemos el eluído
6. Mezclamos el eluído obtenido y leemos la absorbancia

- Lectura en el espectofotómetro

Leemos el eluído obtenido y la hemoglobina total frente a un blanco de agua destilada:

- Agua destilada: 0,000 A

- Eluído obtenido: 0,146 A

- Hemoglobina total: 0,921

Lectura y resultado

- Realizamos los cálculos con los resultados obtenidos:
(A Hb A1c)/ (3 x Hb total) x 100 = % Hb A1c
0,146/(3x 0,921) x 100= 5,28 %
Nuestro resultado está entre los valores normales, que son entre : 
4,2-6,2%