Práctica 11: Cuantificación de una proteína sanguínea por inmunodifusión radial

Cuantificación de una proteína sanguínea por inmunodifusión radial

Objetivo

La inmunodifusión radial es una técnica cuantitativa muy sensible que se utiliza a menudo para detectar los niveles de determinadas proteínas sanguíneas del paciente. En esta práctica, vamos a determinar cuantitativamente una concentración desconocida de una proteína.

Fundamento

El Ac se incorpora a la agarosa fundida que se vierte en una placa y se deja solidificar, después se cortan pequeños pocillos y se llenan con concentraciones conocidas de Ag que interacciona con el Ac.

Significado clínico

La inmunodifusión radial (RID) es una técnica que puede determinar cuantitativamente la concentración de una Ag. A diferencia de muchas técnicas de precipitación en gel y líquido que detectan cuantitativamente el Ag, el RID es una técnica cuantitativa sensible que se usa a menudo clínicamente para detectar niveles de proteínas sanguíneas en pacientes.

Materiales

• Micropipetas automáticas 

• Puntas de pipetas desechables

• Pipetas 

• Placas de petri

Muestra

• Solución Ag estándar
• Solución Ag desconocida

Reactivos

• Agarosa

• Tampón

Aparataje

• Microondas
• Baño termostático

Procedimiento

- Preparación del tampón

1. En un matraz erlenmeyer preparamos 200 mL de agua destilada
2. Añadimos un sobre del componenete D ( buffer )
3. Mezclamos
4. De esos 200 mL, separamos 50 mL y los echamos en otro matraz erlenmeyer

- Preparación de las placas de agarosa

1. A los 150 mL de tampón sobrantes le añadimos un sobre de componente C (agarosa) 
2. Lo metemos en el microondas unos 2 minutos hasta que se quede transparente
3. Dejamos que se enfríe a unos 50ºC en el baño termostatizado
4. De los 150 mL anteriormente preparados, separamos 26 mL en un tubo falcon (que mantendremos en el baño) y le añadimos el componente A (anticuerpo)
5. A cada placa petri le añadimos 3 mL de agarosa y dejamos que solidifique aproximadamente durante 10 minutos

- Preparación de las muestras

1. En los tubos eppendorfs vamos añadiendo:

- Tubo E: 75 microlitros de solución Ag estándar

- Tubo D: 10 microlitros de solución Ag desconocida

- Tubo T: 1 mL de tampón ( los 50 mL separados del principio)

2. Preparamos la batería de diluciones:

- Tubo 1:2 : Añadimos 50 microlitros de tampón + 50 microlitros de tubo E y mezclamos

- Tubo 1:4 : Añadimos 50 microlitros de tampón + 50 microlitros del tubo 1:2 y mezclamos

- Tubo 1:8 : Añadimos 50 microlitros de tampón + 50 microlitros del tubo 1:4 y mezclamos

- Tubo 1:16 : Añadimos 50 microlitros de tampón + 50 microlitros del tubo 1:8 y mezclamos

Desechamos los últimos 50 microlitros

- Perforar pocillos

1. Cortamos la punta de una pipeta pasteur
2. Colocamos la placa encima de la plantilla
3. Con mucho cuidado metemos la pipeta en el gel, justo encima del agujero de la plantilla, y hacemos el agujero. Cuando lo tengamos, debemos extraer el gel
4. En total debemos hacer 6 agujeros

- Cargar patrones/muestra

1. Añadimos 5 microlitros de cada tubo ( E, 1:2, 1:4, 1:8, 1:16) en los pocillos periféricos
2. Añadimos 5 microlitros de tubo D en el pocillo central
3. Los metemos en la cámara húmeda y los dejamos unas 48 horas

Lectura y resultados

Podemos observar, que alrededor de los pocillos que hicimos hay una serie de halos. 
Para poder hacer la curva de calibración, debemos medir el diámetro de los diferentes halos y con sus respectivas concentraciones realizamos la curva. Además debemos extrapolar el diámetro de la muestra problema, para conocer cual es su concentración. 
No debemos olvidar pasar las medidas, que están en cm, a milimetros y elevarlas al cuadrado.

- Cálculo del diámetro
- Pocillo central: 1,2 cm - 12 mm - 144 mm
- Pocillo 1: 1 cm (radio) - 20 mm - 400 mm
- Pocillo 2: 1,5 cm - 15 mm - 225 mm
- Pocillo 3: 1,2 cm - 12 mm - 144 mm
- Pocillo 4: 0,9 cm- 9 mm- 81 mm
- Pocillo 5: 0,8 cm - 8 mm - 64 mm

- Concentraciones
- Pocillo central: ?? mg/ml
- Pocillo 1: 2 mg/ml
- Pocillo 2: 1 mg/ml
- Pocillo 3: 0,5 mg/ml
- Pocillo 4: 0,25 mg/ml
- Pocillo 5: 0,125 mg/ml

*Concentración del problema con la ecuación de la recta
144= 179x + 43,8
179x = 100,2
x= 0,56 mg/ml