Práctica 10: Identificación y cuantificación de proteínas plasmáticas en suero

Identificación y cuantificación de proteínas totales en suero

Objetivo

El objetivo de esta práctica es separar las proteínas en sus distintas globulinas (alfa, beta, gamma y albúmina) e interpretarlas

Fundamento

Las proteínas, moléculas anfóteras, en medio básico adquieren una carga global negativa que hace que migren del cátodo hacia el ánodo cuando son sometidas a un proceso electroforético. 

Como consecuencia de esta migración, se obtienen habitualmente cinco fracciones correspondientes a diferentes proteínas plasmáticas con carga negativa decreciente: 

- Albúmina

- Alfa1-globulina

- Alfa2-globulina

-Beta-globulina

-Gamma globulina

Material

• Cubeta para la electroforesis 

• Fuente de alimentación

• Aplicador

• Tiras de acetato de celulosa

• Láminas Mylar

• Puente electroforético 

Muestra

• Suero problema

Reactivos 

• Solución tampón (Tris hipurato)

• Colorante rojo ponceau

• Decolorante rojo ponceau (ácido cítrico o acético al 5%)

• Solución transparentadora

• Solución disolvente (ácido acético al 80%)

Aparataje

• Horno 
• Fotodensitómetro

Procedimiento

- Preparación del decolorante

1. Disolvemos un sobre de ácido cítrico en polvo en 1000 mL de agua destilada
2. Mezclamos para que se disuelva bien
3. Repartimos en dos cubetas diferentes

- Preparación de las tiras

1. Cogemos las tiras de celulosa y las introducimos en una cubeta que tiene 100 mL de buffer. Están metidas en la cubeta por 10-15 minutos
2. Una vez pasado ese tiempo, las cogemos y las secamos un poco con papel de filtro
3. Colocamos la tira en el puente electroforético con cuidado de que este boca arriba (la esquina cortada debe estar abajo y a la derecha) y que los extremos estén por fuera
4. Añadimos en la cubeta de electroforesis el tampón que hemos utilizado para las tiras y metemos los puentes. Debemos asegurarnos que los extremos que estaban por fuera toquen el tampón. 
5. Colocamos el puente del polo negativo al positivo, para que la muestra corra del negativo al positivo. Hacemos esto, porque la muestra es negativo y si la ponemos del revés la muestra no aparecería en la tira.
6. Aplicamos la muestra, utilizando el aplicador. La aplicación deberá hacerse a unos 2 cm del borde y en el centro. 
7. Tapamos la cubeta con la tapa
8. Conectamos la fuente de alimentación y la programamos a 200 voltios durante 35 minutos. 
9. Una vez que haya terminado, desconectamos la fuente y quitamos las tiras del puente
10. Sumergimos las tiras en el colorante (rojo de ponceau) durante 5 minutos.
11. Cuando pase el tiempo del colorante, introducimos las tiras en las cubetas que tienen el decolorante. Aplicamos 3 o 4 baños sucesivos hasta obtener un fondo claro.
12. Cuando las tiras estén decoloradas, las sumergimos en la solución transparentadora durante 1 minuto
13. Sacamos las tiras y las colocamos sobre una superficie lisa y pasamos un rodillo por encima para eliminar el exceso de solución trasnparentador y las posibles burbujas.
14. Calentamos la tira a 80ºC en el horno durante 10 minutos

Lectura y resultados

- Tras el transparentado, introducimos la tira en el fotodensitómetro y procedemos al trazado del proteinograma y a la cuantificación por fracciones. 

• Área total bajo pico: 276
• Albúmina: 128
• No ha medido las betas
• Gamma: 100

Porcentajes:

- Albúmina: 46,37%

- Gamma: 36,23%