Práctica 9: Determinación cuantitativa de proteínas totales

Determinación cuantitativa de proteínas totales

Objetivo
Realizamos la determinación de proteínas totales por el método biuret

Fundamento
En medio alcalino, las proteínas dan un intenso color violeta azulado en presencia de sales de cobre: Contiene yoduro como antioxidante. 
La intensidad del color formado es proporcional a la concentración de proteína total en la muestra ensayada.

Significado clínico
Las proteínas son compuestos orgánico macromoleculares, simplemente distribuidos por el organismo. Actúan como elementos estructurales y de transporte. Se dividen en dos fracciones: Albúminas y globulinas. 
Su determinación es útil en la detección de: 
- Hiperproteinemia producidas por hemaconcentración, deshidratación o aumento en la concentración de proteínas específicas.
- Hipoproteinemia por hemodilución debida a un defecto en la síntesis proteica, pérdidas excesivas o catabolismo proteico excesivo. 
El diagnostico clínico debe realizarse teniendo en cuenta todos los datos clínicos y de laboratorio.

Materiales

• Micropipetas de 25 y 1000 microlitros

• Puntas de pipeta desechables

• Cubetas de espectofotometría 

• Tubos de hemólisis de 3 mL

• Tapones

Muestra

• Suero o plasma heparinizado

Reactivos

• Biuret

• Calibrador de proteínas 

Aparataje

• Espectofotómetro

• Baño termostático a 37ºC

Procedimiento
1.Atemperamos los reactivos a Tª ambiente 
2.Encendemos el espectofotómetro y lo programamos a 540 nanómetros
3.Realizamos el blanco, el patrón y la muestra
 - Blanco: 1 mL de biuret

 - Patrón: 1 mL de biuret y 25 microlitros de patrón de proteínas 

 - Muestra: 1 mL de biuret y 25 microlitros de muestra

4.Mezclamos e incubamos durante 5 minutos a 37ºC en el baño termostático

5.Ajustamos el espectofotómetro a cero con el blanco

6.Leemos la absorbancia del patrón y la muestra frente al blanco del reactivo. El color es estable como mínimo 30 minutos.

7.Resultados son: 

- Blanco: 0.000 A

- Patrón: 0,518 A

- Muestra: 0,323 A

Resultados
Para calcular la concentración, realizamos la siguiente fórmula:
(A)muestra/(A)patrón*7= concentración g/dL de proteínas totales
0,323 A/ 0,518 * 7= 4,36 g/dL