Práctica 3: Cuantificación de proteínas en orina con ácido sulfosalicílico por turbidimetría

Cuantificación de proteínas en orina con ácido sulfosalicídico por turbidimetría

Objetivo

El objetivo es practicar los conceptos de turbidimetría aprendidos en clase

Fundamento

La adición de ácido sulfosalicílico a una solución de proteínas actúa sobre estas, dando lugar a la aparición de un fino precipitado en suspensión. Este precipitado se observa como una turbidez blanquecina cuya intensidad puede ser cuantificada por turbidimetría.
Basándonos en este método turbidimétrico vamos a cuantificar la concentración de proteínas presentes en una muestra de orina.

Materiales

• Tubos de ensayo de 5mL y gradilla

• Micropipeta de 50 microlitros

• Puntas de pipeta desechables 

• Pipeta graduada de 10 mL y auxiliar de pipeteo

• Cubetas de espectofotometría

Muestra

• Orina sin centrifugar

Reactivos

• Patrón de proteínas 

• Ácido sulfosalicídico

• Suero salino fisiológico

Aparataje

• Balanza analítica

• Espectofotómetro

Procedimiento 

- Preparación de la primera batería de diluciones y de la solución de ácido sulfosalicídico

1. Preparamos los tubos en las gradilla y los rotulamos con D1, D2, D3 y D4.
2. A cada tubo le añadimos 10 mL de suero salino fisiológico
3. Al D1 le quitamos 50 microlitros de suero, al D2 100 microlitros, al D3 200 microlitros y al D4 400 microlitros
4. A continuación le añadimos a cada tubo la cantidad que le hemos quitado de patrón de proteínas, es decir, al D1 50 microlitros, al 2 100 y así hasta el D4.
5. Resuspendemos para mezclar el patrón con el suero y tapamos con parafilm
6. Para preparar el ácido sulfosalicídico pesaremos el ácido y haremos la disolución con agua destilada
7. Como vamos a preparar 100mL y ácido sulfosalicíco está al 3% (p/v), tendremos que pesar 3 gramos de ácido
8. Cuando lo tengamos pesado, lo mezclaremos con los 100 mL de agua destilada y lo almacenaremos en un bote

- Preparación de la batería de dilución

1. Preparamos 7 tubos de 5 mL y los retulamos: 4 tubos iran como P1, P2, P3 y P4; 2 tubos serán los blancos, uno de ellos BR (blanco reactivo) y BM (blanco de muestra) y el último tubo será PB (la muestra problema)
2. A cada tubo le añadimos:

- Tubo P1: 0,5 mL de la disolución del D1 y 2 mL de ácido sulfosalicídico

- Tubo P2: 0,5 mL de la disolución del D2 y 2 mL de ácido sulfosalicídico

- Tubo P3: 0,5 mL de la disolución del D3 y 2 mL de ácido sulfosalicídico

- Tubo P4: 0,5 mL de la disolución del D4 y 2 mL de ácido sulfosalicídico 

- Tubo BR: 0,5 mL de suero salino fisológico y 2 mL de ácido sulfosalicídico

- Tubo BM: 0,5 mL de suero salino fisiológico y 0,5 mL de orina 

- Tubo PB: 0,5 mL de orina y 2 mL de ácido sulfosalicídico

3. Tapamos los tubos con tapones y procedemos a leer la absorbancia 

4. Programamos el espectofotómetro a 660 nm 

5. Invertimos los tubos y prodecemos a llenar las cubetas de espectofotometría

6. - Ajustamos a cero el fotómetro con el BR

    - Medimos la absorbancia de P1, P2, P3 y P4

    - Ajustamos a cero el fotómetro con el BM

    - Medimos la absorbancia del PB

Resultados

Absorbancias: 
P1- 0,328
P2- 0,640
P3- 1,010
P4- 1,601
PB- 0,587

Curva de calibración: