Práctica 1: Construcción de una curva de calibración y manejo del espectofotómetro

 Construcción de una curva de calibración y manejo del espectofotómetro

Objetivo
El objetivo principal de la práctica es, como bien describe el título, realizar una curva de calibración de dos colorantes con ayuda del espectofotómetro, y también aprender a manejar este último. 

Utilidad clínica
Realizaremos está práctica para conocer un poco las técnicas de espectofotometría y para aprender a usar los espectofotómetros. Al final de la práctica haremos unas curvas de calibración con ayuda de los aparatos. 

Fundamento
Un gran número de las determinaciones que se realizan se basan en la medida de la interacción de la materia con un espectro de energía radiante. La energía radiante se obtiene a partir de una fuente luminosa/calorífica/química. Como la energía radiante utilizada en estas técnicas es de tipo electromagnético y está formada por una sucesión de fotones dotados de movimiento ondulatorio, todas estás técnicas se agrupan bajo la denominación de espectofotometría. 

Aparataje

• Espectofotómetro de absorción

Se utiliza para las medidas de absorción de la REM. 
En el laboratorio tenemos un fotómetro o colorímetro y dos espectofotómetros. 

Materiales

• 2 erlenmeyer 

• Pipetas manuales y automáticas

• Tubos de ensayo 

• Cubetas de espectofotometría

• Gradilla

Reactivos

• Colorante azul con una concentración de 800 mg/dL

• Colorante rojo con una concentración de 600 mg/dL

Procedimiento

Utilizaremos dos colorantes como analitos con capacidad cromógena para elaborar dos baterías de dilución seriadas. Con ellas realizaremos medidas espectofotómetricas. 

1. Elaboramos las baterías de dilución seriadas:

- La primera de ellas será la del colorante azul y constará de 5 tubos con 4 mL cada uno y un factor de dilución 1/2. 

La otra será la del colorante rojo y estará formada por 4 tubos con 3 mL cada uno y un factor de dilución 1/3. 

*No debemos olvidar que el primer tubo de cada batería contendrá el colorante correspondiente procedente de cada erlenmeyer y estará sin diluir (dilución madre). 

- Antes de llenar ningún tubo, debemos hacer los cálculos correspondientes a cada dilución, para ello utilizaremos la fórmula del volumen de paso: Vp= Vf/x-1

Cuando tengamos los cálculos, procedemos a realizar las baterías:

- Batería azul: 

El tubo 1 lo llenaremos con el colorante azul que está contenido en erlenmeyer con ayuda de una pipeta, en este primer tubo echaremos 8 mL de dilución madre, ya que pasaremos 4 mL de esta al tubo 2. Todos los demás tubos (el 2,3,4 y 5) los llenaremos cada uno con 4 mL del disolvente, en este caso agua destilada. Una vez llenos pasaremos 4 mL del tubo 1 al tubo 2, mezclaremos un poco con la pipeta y después pasaremos 4 mL del tubo 2 al 3 y así hasta el tubo 5, en el que los 4 mL restantes los desecharemos a un tubo de rechazo. 

- Batería roja 

El tubo 1 lo llenaremos con el colorante rojo directamente desde el erlenmeyer, es este tubo echaremos 6 mL de colorante. 

Todos los demás tubos estarán llenos con 6 mL de agua destilada. 

Haremos lo mismo que con el azul, del tubo 1 pasaremos 1,5 mL al tubo 2, mezclamos y pasamos 1,5 mL al tubo 3, así hasta que lleguemos al 4. En el tubo 4 desecharemos 1,5 mL al tubo de rechazo. 

2. Elegiremos las longitudes de onda correspondientes a cada cromógeno, para ellos utilizaremos un espectofotómetro que leerá la longitud de onda de los cromógenos. En el caso del azul, nos dio una longitud de onda de 662 nm y en el rojo de 499 nm. 

3. Medir la absorbancia de cada uno de los tubos en ambas baterías, y con los datos obtenidos elaboramos las curvas de calibración. 

Para medir la absorbancia ponemos en marcha el espectofotómetro, mientras vamos llenando cubetas de espectofotometría con las diluciones.

*Hay que tener mucho cuidado con las cubetas, ya que si tocamos o ensuciamos la parte por la que leen la absorbancia habrá errores. 

Lo primero que leeremos será el blanco, que es un reactivo sin muestra, es decir es el disolvente que utilizamos (agua destilada). 

El blanco se realiza con objeto de eliminar interferencias. 

Una vez hecho el blanco, metemos la cubeta en el espectofotómetro y sus caras transparentes irán en dirección en la que la luz  las atraviese. 

Color azul: 

• Tubo 1 - 1,027
• Tubo 2 - 0,524
• Tubo 3 - 0,255
• Tubo 4 -  0,120
• Tubo 5 -  0,056

Color rojo 

• Tubo 1 - 2,0969 
• Tubo 2 - 0,8592
• Tubo 3 -  0,2876
• Tubo 4 - 0,0949

4. A partir de las absorbancias obtenidas en el espectofotómetro y la concentración que obtenemos con el factor de dilución, realizamos las curvas de calibración. 

Adjuntamos foto

Además de las dos baterías de diluciones, tenemos dos disoluciones problema en las que solo sabemos la longitud de onda y no sabemos ni la absorbancia ni la concentración.

Preparamos el espectofotómetro y medimos el problema de color rojo y el problema azul:

• Problema rojo - 0,583
• Problema azul - 1,448

Para conocer su concentración encontramos la absorbancia en las curvas que hemos hecho anteriormente y cuando coincida con la otra línea apuntamos la concentración.