Práctica 7: Separación de una mezcla de aminoácidos por cromatografía en capa fina

Separación de una mezcla de aminoácidos por cromatografía en capa fina

Objetivo

El objetivo es realizar una separación e identificación de los aminoácidos triptófano, alanina, valina y arginina presentes en una muestra mediante una cromatografía de capa fina ascendente.

Fundamento

La cromatografía permite la separación de los componentes de una mezcla y los identifica.

Significado clínico

Hay enfermedades clínicas en la que se produce una alta concentración de aminoácidos (aa) en el plasma y la origina. Este desequilibrio se denomina aminoaciduria. 

Uno de los análisis empleado para la detección de aa es una muestra biológica es la cromatografía en capa fina. Esta cromatografía es una técnica de separación e identificación de sustancias químicas disueltas en un disolvente (fase móvil) que se mueve sobre una capa delgada de un absorbente idóneo (fase estacionaria).

La fase estacionaria está dispuesta en una fina lámina que está cubriendo un soporte de vidrio o plástico. El material empleado en la fase estacionaria depende del tipo de muestras a separar. Para separar aa se utilizan gel de sílice, alúmina, almidón y geles de celulosa. La fase móvil también depende del tipo de moléculas a separar, utilizándose disolventes o mezclas de disolvente de diferente polaridad. 

Materiales

• Láminas de gel de celulosa

• Vaso de precipitados

• Micropipeta de 5 microlitros

• Puntas de pipeta desechables

• Vaso de rechazo

Muestra

• Muestra patrón con aminoácidos

• Muestra problema con una mezcla desconocida de aminoácidos

Reactivos

• Disolvente de cromatografía (fase móvil)

• Disolución reveladora (nihidrina)

Aparataje

• Estufa

Procedimiento

- Preparación de la fase móvil

1. La fase móvil se prepara mezclando butanol, ácido acético, acetona y agua. 
2. En un bote llevará: 50 mL de agua, 50 mL de acetona, 50 mL de acético y 200 mL de butanol

- Preparación de nihidrina 

1. Para preparar la nihidrina mezclamos en un atomizador: 0,2 gramos de nihidrina y 100 mL de acetona

- Preparamiento de la muestra

1. Cogemos la placa de gel de celulosa de 10 x 5 cm y con un lápiz marcamos los límites de la placa. Dibujamos una línea a 1,5cm del extremo de la placa y en esa línea dibujamos 2 círculos a 1 cm (más o menos) el uno del otro, que serán para colocar las muestras.
2.  Metemos la placa en el vaso de precipitados y medimos por dónde quedan los dos círculos de las muestras para saber que cantidad añadimos de fase móvil. *La fase móvil debe quedarse por debajo de las muestras*
3. Añadimos la fase móvil al vaso de precipitados y tapamos
4. Con la placa en horizontal, añadimos 3 microlitros de cada muestra a los círculos, 3 microlitros de muestra problema y 3 microlitros de patrón, apoyando suavemente la punta de la pipeta sobre el punto. 
5. Dejamos que las manchas se sequen al aire
6. Cuando estén secas, introducimos la placa en el vaso de precipitados de forma vertical y dejamos que la fase móvil suba por capilaridad durante media hora o una hora
7. Cuando haya subido como unos 8 cm, sacamos la placa y marcamos con un lápiz hasta donde ha subido la fase móvil
8. Colocamos la placa en una bandeja de cristal y la metemos a que se seque en una estufa 
9. Cuando esté seca, la rociamos con la nihidrina, la pulverización debe hacerse suave y uniformemente. Debemos evitar el exceso, ya que puede chorrear. Esta parte la hicimos en la calle para no inhalar el pulverizado
10. Calentamos la placa en la estufa unos 10 minutos a 120ºC 
11. Cuando lo saquemos las manchas de los aminoácidos de color rosáceo aparecerán distribuidas a lo largo del gel

Resultados

En cada  patrón de aminoácido obtendremos una mancha característica. En la mezcla problema, obtendremos tantas machas como aa existan en ella. La posiciónde lospatrones nos ayudará a identificar los aa de la muestra. 

También podemos identificar los aa de la mezcla mediante un parámetro cromatográfico denominado relación frente del solvente. La relación al frente del solvente (Rf) o migración relativa de una sustancia en una fase móvil (disolvente) y estacionaria (gel) determinada va a ser constante. Esta característica nos permite, mediante la comparación con patrones, la identificación de la sustancia en una mezcla. El valor del recorrido relativo (Rf) de un compuesto es una medida de la migración de este compuesto comparado con la migración eyulente. 

Rf=distancia recorrida por el compuesto desde el origen (cm)/ distancia recorrida por el eyulente desde el origen (cm)

Cálculos

• Aminoácidos:

- Arginina: 0,3-0,35

-Ácido glutámico: 0,60-0,75

- Fenilalamina: 0,70-0,85

• Medidas de las manchas ( de abajo hacia arriba)

- Primera mancha (x): 1 cm

- Segunda mancha (y): 2 cm

- Tercera mancha (z): 2,6 cm 

- Recorrido total de la fase móvil (m): 3,5 cm

• Cálculos

x/m- 1/3,5= 0,29 - arginina

y/m- 2/3,5= 0,57  - ácido glutámico 

z/m- 2,6/3,5= 0,74 - fenilalamina

Nuesto aa problema es el ácido glutámico